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Soin des plantes haworthia

Soin des plantes haworthia



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Soin des plantes haworthia

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introduction

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Pour établir des plantes de *Lepidium*, il est recommandé d'effectuer les étapes suivantes : (i) cultiver les graines, (ii) les maintenir sous forme de boutures et établir des racines dans un substrat de rempotage stérile, (iii) développer un certain nombre de véritables -typer les clones et implanter les plantules dans du sable stérile. Les conditions de croissance doivent être : 25--30°C, 16--24 heures de lumière, et le substrat additionné d'engrais (azote + phosphore + potassium à 20 + 20 + 20 mg/l, respectivement).

Si nécessaire, une reproduction asexuée par graines peut être réalisée. A cet effet, les embryons de plantes doivent être sélectionnés au stade 5--6 de développement puis germés dans un substrat avec un milieu contenant une forte concentration de sucre (20%) et de vitamine C. Lorsque les plantules de la taille désirée apparaissent sur la surface du milieu, elles sont transférées dans le substrat à teneur réduite en sucre (10 %). En règle générale, le substrat est humidifié à environ 50 à 70 % de sa masse sèche. Une fois que les semis ont germé, ils doivent être conservés pendant au moins 3 semaines dans un substrat enrichi en nutriments et à la lumière à une température de 16--24°C.

Nous utilisons des boutures obtenues à partir de la plante mère ou des plantules développées sur le sable comme moyen de reproduction asexuée. Les boutures doivent être prélevées sur des semis à 1--2 feuilles (Figure [1](#F1){ref-type="fig"}), une surface foliaire qui n'a pas été endommagée pendant la période de croissance (pas de points noirs) , et un système racinaire bien développé. Chacune des feuilles coupées du semis doit être placée sur un petit plat avec le capuchon racinaire pointant vers le haut et recouverte d'un couvercle en plastique pour maintenir l'humidité. Les plantes commenceront à pousser dans les prochains jours et les racines sortiront de la tige. De cette façon, plusieurs clones seront obtenus. La même procédure doit être utilisée pour obtenir des boutures à partir de semis obtenus par micro-propagation.

![**Plantes avec feuilles et racines**. Les plantes représentées sur cette figure ont poussé sous serre pendant plusieurs mois dans un substrat peu concentré en sucre (3%). Les plantes présentées à droite ont été obtenues par micro-propagation.](1471-2229-9-76-1){#F1}

Substrat, média et conditions

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Toutes les plantes développées dans notre laboratoire sont cultivées dans un environnement contrôlé (serre) dans un substrat appelé Sunshine^®^Pro Grow^®^. Ce substrat contient différents composés (par exemple, carbonate de calcium, dolomie, perlite, pierre ponce et argile) et est utilisé pour le développement de cultures dans des conditions semi-stériles (Figure [2A](#F2){ref-type="fig"} ). Pour obtenir une croissance maximale, le substrat est saturé d'eau et d'engrais (avec une concentration de 8,5 mM K, 0,12 mM Mg, 0,24 mM S, 0,24 mM N, 0,24 mM P, 0,02 mM B, 0,04 mM Ca, 0,064 mM Cu, 0,1 mM Fe, 0,06 mM Mn, 0,074 mM Mo, 0,06 mM Zn, 2,7 mM SO~4~) est ajouté. Le pH du substrat est également contrôlé (6,5).

![**Plantes dans la chambre de croissance**. A) plantes obtenues à partir de graines propagées dans Sunshine^®^Pro Grow^®^, B) plantes cultivées dans des boîtes de Petri remplies de substrat de croissance, et C) plantes dans Sunshine^®^Pro Grow^®^cultivées en pots.]( 1471-2229-9-3-2){#F2}

Pour faire pousser des plantes dans la chambre de croissance, le substrat est versé dans des boîtes de Pétri de 13 cm de diamètre, stérilisé à l'éthanol et placé dans la chambre de croissance (Figure [2B](#F2){ref-type="fig"}).

Dans la chambre de croissance, les plantes sont fertilisées selon les concentrations en nutriments définies dans le substrat : 0,05 mM K, 0,01 mM Mg, 0,25 mM S, 0,25 mM N, 0,15 mM P, 0,06 mM Ca, 0,08 mM Cu, 0,02 mM Fe, 0,04 mM Mn, 0,04 mM Mo, 0,02 mM Zn, 0,5 mM Na~2~SO~4~ et 0,2 mM KCl. Pour contrôler le pH (6,5) et les concentrations de nutriments, le substrat est pompé dans la chambre de croissance. Pour éviter une forte carence en éléments nutritifs, toutes les plantes sont arrosées trois fois par semaine et les plantes sont rempotées lorsque les pousses ont atteint une longueur d'environ 5 à 8 cm.

Pour obtenir des plantes en pots, les racines sont lavées des plantes et elles sont plantées dans des pots contenant du Sunshine^®^Pro Grow^®^(Figure [2C](#F2){ref-type="fig"}).

Microscopie optique et anatomie végétale

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Pour la microscopie, les racines excisées, les jeunes sections de feuilles, la tige *Arabidopsis*, les fleurs, les pétales et les graines sont incubés dans de l'éthanol à 100 % pendant au moins 24 h et placés dans de l'eau distillée jusqu'à ce qu'ils soient montés sur des lames de verre et imagés au microscope optique.

Pour l'étude détaillée de l'anatomie du phloème, les feuilles sont excisées et fixées dans de l'éthanol:acide acétique (3:1). Les échantillons fixés sont nettoyés dans une solution d'hydrate de chloral et les échantillons sont coupés en sections avec un microtome vibrant et colorés au bleu d'aniline (Gouget et al., [@B15]). Les échantillons sont ensuite montés avec une lamelle et scellés avec de la colle. L'anatomie du tube de tamis Phloem est documentée dans les images générées dans le logiciel d'analyse d'images PlantScribe^™^.

Microscopie confocale à balayage laser

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Les graines, les embryons, les tiges et les feuilles des plantes sont fixés avec du paraformaldéhyde à 4 %. Les tissus excisés sont montés dans du Triton X-100 à 0,1 % puis imagés à l'aide d'un microscope à balayage laser Zeiss LSM 510-META (Carl Zeiss, Jena, Allemagne).

Expression de la GFP dans les fleurs et les pétales

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Les jeunes fleurs ont été obtenues à partir de plantes GFP hétérozygotes et elles ont été excisées, étalées et immergées dans du Triton X-100 à 0,1 %. Les pétales ont été imagés au microscope confocal à balayage laser.

Exsudation du phloème et mesures du sucre

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Les graines ont été semées sur des plaques de gélose. Les plants ont été transplantés dans des pots pour la culture des racines. Une tige de 1 cm de long a été coupée avec une lame de rasoir et le sommet de la tige a été immergé dans une solution d'acétone de rutine (0,1 mg/mL) pendant 1 h. Les sucres libérés du phloème dans le milieu externe ont été mesurés par HPLC (Waters 1525, Milford, MA, USA) avec détection de fluorescence.

Extraction d'ARN total et qRT-PCR

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L'ARN total a été extrait de plantes âgées de 3 à 4 semaines à l'aide d'un kit d'extraction d'ARN (Promega, Madison, WI, USA) en suivant les instructions du fabricant. L'ARN total a été traité avec de la DNase sans RNase (Promega) pour éliminer la contamination de l'ADN génomique. L'ADNc premier brin a été synthétisé à l'aide d'un kit de synthèse d'ADNc (Takara, Dalian,


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